2003年，17岁的周美毅便成为了广州芭蕾舞团的一名芭蕾舞演员，而她出演的舞剧《梅兰芳》则获得了第3届全国舞剧观摩演出最佳剧目奖。

2004年，周美毅出演了芭蕾舞剧《梁山伯与祝英台》，此剧则获得了第4届中国舞蹈荷花奖舞剧铜奖；同年，周美毅还参加了第12届美在花城广告新星大赛,，并获得了比赛的最佳表演奖。

2006年，周美毅参加了首届南方小姐选美大赛，并最终凭借不俗的表现获得了比赛的十佳选手、最具亲善奖和最受传媒欢迎奖；同年，周美毅还参加了深圳广电集团电视剧频道举办的“我是女主角”选拔活动，周美毅也最终获得了活动的最受观众欢迎奖和最上镜奖，并成为了深圳电视台电视剧频道的形象代言人。

2007年，周美毅开始担任深圳电视台《时尚装苑》等电视节目的主持人；随后，周美毅参加了红楼梦中人全球选秀活动，并最终一路过关斩将获得了宝钗组全国十强的成绩；同年，周美毅还与众多艺人共同出演了个人的首部电视剧作品《真情人生》。

2008年，在经过一系列的专业训练之后，周美毅顺理成章的出演了李少红版《红楼梦》，并在剧中饰演了金陵十二钗之一的李纨；同年，周美毅还在与宋春丽、于小慧、李成儒等艺人合作出演的都市家庭剧《穷妈妈富妈妈》中饰演了善良纯真的80后女孩钟克敏。

2010年，周美毅与归亚蕾、蔡飞雨、马少骅共同出演了根据真实历史事件改编的近代传奇剧《杨翠喜案》，并在剧中饰演了出身望族却命运多舛近代新女性四格格；随后，周美毅又在与马晓灿、林申、茹萍联袂主演的都市情感剧《给你生命给我爱》中饰演了命运坎坷却乐观坚强的女主角路桐；同年，周美毅还出演了个人的首部电影作品，她与陆思宇搭档主演了现代纯爱片《狠狠爱》，并在片中饰演了坚强敢爱的女主角小米。

2011年，周美毅先是与林申、李沁、王时雨合作主演了民国悬疑片《落难神偷》，周美毅在片中饰演了妖娆多姿的旧上海女明星周梦雅；之后，周美毅又与蒋梦婕、许绍洋、秦子越联袂主演了民国言情剧《刺青海娘》，并在剧中饰演了对好姐妹有情有义的美丽女子蔡有君；同年，周美毅还与张嘉倪、李沁、林申等艺人共同出演了都市纯爱剧《花开半夏》。

2012年，周美毅先是主演了根据真人事迹改编的公益温情电影《美丽心灵》，并在片中饰演了身残志坚的美丽女教师刘云；随后，周美毅又与俞潇春、于瑛楠、丁曼联袂主演了现代爱情片《离不了的婚》，周美毅在片中饰演了遭遇感情困扰的女主角余安安；同年，周美毅还与刘涛、黄觉、万妮恩合作出演了民国悬疑剧《迷局1927》，并在剧中饰演了妩媚性感却爱财如命的富家姨太太刘香菱；此外，周美毅还客串出演了现代家庭剧《我的左手右手》。

2013年，周美毅先是与孙菂、丁军、周艳泓联袂主演了近代革命剧《代号麻雀》，并在剧中饰演了美艳绝伦且心机深沉的日本女间谍春花；之后，周美毅又与李柱贤、郑凯、米雪合作出演了都市商战剧《酒店世家》，周美毅在剧中饰演了为爱不求名分的痴情女子顾莉雅；同年，周美毅还在与赵文瑄、李沁、李易峰等众多艺人共同出演的现代励志剧《千金归来》中饰演了生性善良却迫于生计被人利用的多面女子赵真真；此外，周美毅还与严屹宽、李念、陈锦鸿合作主演了民国传奇剧《绞刑架下的春天》，并在剧中饰演了红颜薄命的美丽女子窦春宵；以及，与明道、李沁、胡兵共同出演了都市言情剧《如果我爱你》。

2014年，周美毅与宋茜、蒋劲夫、杨洋合作出演了年代悬疑剧《茧镇奇缘》。2015年，周美毅与刘恩佑、吕一、何明翰等人联袂出演了抗战动作剧《大道天行》，周美毅在剧中饰演了拥有妙曼身姿和迷人的嗓音的上海滩名媛满优。

2016年，周美毅与唐嫣、罗晋、吴建豪等人合作出演了根据同名小说改编的古装宫廷传奇剧《锦绣未央》，而她则在剧中饰演了阴险毒辣且诡计频出的腹黑美人春茗。同年，周美毅出演的电视剧《咱们相爱吧》于11月7日登陆湖南卫视金鹰剧场。

选秀类

• 2007红楼梦中人-全球选秀宝钗组全国十强（提名）
• 2007红楼梦中人-全球选秀最佳才艺奖（获奖）
• 2006第1届南方小姐选美大赛最受传媒欢迎奖（获奖）
• 2006第1届南方小姐选美大赛最具亲善奖（获奖）
• 2006第1届南方小姐选美大赛十佳选手（提名）
• 2006深圳电视台《我是女主角》选拔赛最受观众欢迎奖（获奖）
• 2006深圳电视台《我是女主角》选拔赛最上镜奖（获奖）
• 2004第12届美在花城-广告新星大赛最佳表演奖（获奖）

在新版《红楼梦》播出后观众们认识了十二金钗之一李纨的饰演者周美毅，她温婉大方的表演不仅获得了专家学者的极高赞誉，也让李少红导演评价她是剧中最接近人物角色的演员。

从小学习芭蕾舞的周美毅因在多部芭蕾舞剧中的出色表演而赢得了“芭蕾公主”的称号，印象中的她温婉娴静，而在一组个人时尚写真中身着白色素净短裙的她则将自己清新恬净、美丽优雅的气质展现的淋漓尽致。

因在李少红版《红楼梦》中饰演“李纨”一角脱颖而出的周美毅，其温婉、大气的少奶奶形象也深入人心。而在苦情剧《给你生命给我爱》中，她又摇身一变，成了孤苦、坚强的励志女孩“路桐”，虽然角色的特点与周美毅在现实生活中的状态有异，但周美毅却凭借对角色的认真研究和自然逼真的演技将这个角色诠释的入木三分。